1.1復色光對比耳定律的偏離

比耳定律成立的前提條件是人射光是單色光，但是精度再高的儀器，即使是雙單色器的分光光度計，也只能獲得近乎單色的光，無法獲得純單色光，它仍然含有狹窄光通帶，具有復色光的性質。而復色光會導致比耳定律的正或負偏離。

固定狹縫的紫外分光光度計光譜帶寬一般為1nm或2nm，可調狹縫的可以做到0.Inm；可見分光光度計帶寬6nm、snm，甚至十幾納米。

光譜帶寬應該是越小越好，但是隨著光譜分辨率的提高，儀器的靈敏度降低，所以選擇儀器時要綜合考慮各種條件的影響。當溶液濃度較小且單色光較純時，可近似認為符合比耳定律。

1.2雜散光的影響

雜散光是指進人檢測器的處于待測波長光譜帶寬范圍外的其他波長組分，它是光譜測量中誤差的主要來源。

產生原因有:分光光度計的色散元件、反射鏡、透鏡及單色器內壁灰塵等。在分光光度計工作波段邊緣波長處，由于單色器透光率、光源輻射強度、檢測器靈敏度都較低，雜散光的影響更為顯著。

雜散光限制儀器的分析上限可引起嚴重的測量誤差，實際工作中，在定量分析時，一般在吸收峰或其附近處測量樣品吸光度，如果在分析波長處含有雜散光，這時樣品的透光率較小，而雜散光大部分透過，使測量吸光度低于真實吸光度。

1.3儀器噪聲對測t的影響

儀器噪聲也是儀器的一個重要指標，它表征儀器做稀溶液的能力。是疊加在待測量的分析信號中的不需要的信號，掃描100%T和0%T線，可觀察到分光光度計的噪聲水平，如果儀器噪聲較大，會掩蓋較小的測量信號，一般用噪音的二倍來表示儀器的靈敏度。

1.4波長和吸光度準確度

樣品的每一個值都是在一定的波長下測得的，如果波長誤差很大，測出的值肯定不準。吸光度準確度也是用戶對儀器的直接要求，更應引起足夠的重視。

國家計量檢定規程規定雙光束紫外可見分光光度計透射比準確度為*士0.6%， B級土1.0%。

2測量條件的選擇

2.1參比溶液和溶荊的選擇

分光光度計的測量實際上是以通過參比池的光強度作為人射光強度來測定試樣的吸光度，先調節儀器使透過參比池溶液的吸光度為零，然后讓同一束光通過樣品，使得吸光度比較真實地反映待測物質的濃度，所以參比溶液的選擇非常重要。

如果僅有待測物質與顯色劑的反應產物有吸收，可用純溶劑或蒸餾水作參比溶液。如果顯色劑有顏色，并在測定波長下有吸收，則用顯色劑溶液作參比溶液，所加人顯色劑及其它試劑的量，與試樣中的加入量應一致。

如果樣品中其它組分本身的顏色對測定有干擾，而所用顯色劑沒顏色，則用不加顯色劑的樣品溶液作參比液。

正確選擇合適的溶劑，對提高分析的準確度起重要作用。為減小溶劑中雜質的影響，應選擇高純度的溶劑；溶劑應不與待測物質發生化學反應；待測物在溶劑中要有一定的溶解度；在測定的波長范圍內，溶劑本身沒有吸收，注意常用溶劑的zui短可用波長；當用揮發性大的溶劑時，測量過程中吸收池應加蓋。

2.2測試波長的選擇

當用分光光度計對溶液進行測定時，首先需要選擇合適的測量波長。選擇的依據是該被測溶液的吸收曲線。在一般情況下，我們總是選擇zui大吸收波長作為測量波長，這樣可以提高靈敏度。

而在有些情況下zui大吸收峰很尖銳、吸收過大或附近有干擾存在，就不能選zui大吸收波長，而必須在保證有一定靈敏度的情況下，選擇吸收曲線中的其它波長進行測定(曲線較平坦處對應的波長)，以消除干擾。繪制吸收曲線是正確選擇波長的有效手段和方法。

3、分光光度計的檢驗小妙招

波長準確度的檢驗

分光光度計在使用過程中，由于機械振動、溫度變化、燈絲變形、燈座松動或更換燈泡等原因，經常會出現刻度盤上的讀數與實際通過溶液的波長不符合的現象，因而導致儀器靈明度降低，影響測定結果的精度，需要進行檢驗。

檢驗波長準確度zui簡單的方法是用干涉濾光片或鐠釹濾光片測量儀器的吸收峰值, 如果測出的值與濾光片標準值之差超出規程規定, 則需要進行波長調節。

透射比正確度的檢驗

用透射比標準值分別為10 %、20 %、30 %左右的光譜中性濾光片，可見光區分別在440、546、635nm波長處，以空氣為參比，分別測量各濾光片的透射比，紫外光區用重鉻酸鉀溶液分別在235、257、313、350nm波長處，以高氯酸溶液為參比，測量其透射比。

穩定度的檢驗

在零點不受光的條件下，用零點調節器將儀器調至零點，觀察3分鐘讀取透射比的變化，即為零點穩定性。在儀器測量范圍兩端向中間靠10nm處，調節零點后，蓋上樣品室蓋(打開光門)，使光電管受光，調節透射比為95%（數顯儀器調至100%）察3分鐘讀取透射比的變化，為光電流穩定性。 

光的檢驗

可見分光計棱鏡式儀器在420nm處，光柵式儀器在360nm處，紫外分光計在220nm處分別用符合規定的截止濾光片，以空氣為參比，測量其透射比值，即為儀器在相應波長下的雜散輻射率。